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[뉴스포럼 8호] Notable Research
관리자 \| 113 \| 2019-12-12 12:23:34
DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction 최종문 (녹십자의료재단/녹십자지놈 진단검사의학과 전문의) 최근 세포의 유전자의 발현을 3D 영상으로 구현하는 방법이 개발되었다.^[1] 이 기술을 이용하면 마치 현미경을 보는 것처럼 유전 산물의 위치를 알 수 있다. RNA가 세포 내 어느 위치에서 Localization 되는지, 조직 내 발현이 높은 세포는 어디인지, 그 양은 얼마나 되는지 알아낼 수도 있다. 사실 여기까지는 별로 새로울 것이 없는 기술일 것이다. 단백질의 발현의 경우 화학 염색이나 면역 화학 염색은 이미 임상 영역까지 확대되어 있다. 특히 형광 현미경을 이용하면 원하는 종류의 단백질을 쥐, 토끼, 사람, 소, 종류별로 항 단백질 항체를 인터넷에서 주문하여 고해상도 영상을 얻을 수 있다. 심지어 제품 카탈로그에 없는 항 단백질 항체는 만들어서 주기도 한다. 단백질뿐 아니라 RNA 발현도 크게 다르지 않다. 세포의 형태를 그대로 유지시키면서, 핵산에 형광이나 화학 표지자를 부합시키는 In Situ Hybridization 기술과 현미경을 이용하면 RNA의 발현을 눈으로 확인이 가능하다.^[2] 그러나 이 신기술에는 기존 기술들과는 다른 차별점이 있다. 첫째, 현미경이 필요치 않다. 대신 차세대 염기 서열 분석(NGS) 장비가 이를 대신한다. 둘째, 표적에 특이적으로 결합하는 Probe가 필요치 않다. 보고자 하는 유전자 타깃의 종류와는 관계없이 동일한 시약으로 모든 타깃을 검출할 수 있다. 셋째, 광학적 특성에 제한을 받지 않는다. 일반적인 형광 표지자를 이용하는 이상 형광 파장 분포에 따른 표지자 수에 제한을 받게 된다. 일반적으로는 2개, 많아 봐야 4개를 쓴다. 여러 타깃을 한 번에 보기 위해서는 기존 기술로는 여러 개의 영상을 하나로 합쳐서 구현하는 수밖에 없는데 이 기술은 형광 표지자를 현미경으로 관찰하는 과정이 없기에 표적 수 제한과는 상관이 없다. 또한 회절 한계(Diffraction Limit)와 같은 광학 현미경이 가진 약점이 없다. 빛의 특성상 파장의 길이보다 작은 물체는 식별이 불가능하다. 분자 단위의 크기를 가진 물체를 식별하기 위해서는 광학 기술 만으로는 충분치 않을 수 있다. 형광을 사용하는 경우 타깃이 너무 한곳에 모여 있으면 다른 약한 신호들은 묻혀 버릴 수도 있으며, 배경 형광(Background Fluresence)과 같은 노이즈나 표적의 두께 등도 큰 문제가 될 수 있다. 이를 해결하기 위해 TIRF(Total Internal Referection Fluoresence)^[3], HILO(Highly Inclined and Laminated Optical Sheet)^[4], SDC (Spinning Disk Confocal Microscopy)^[5] 등 다양한 기술이 시도되고 있으나 이러한 기술 역시 빛을 사용하므로 완전한 해결책은 될 수 없으며 제한된 목적의 검사를 위해 고가의 장비를 구매해야 하는 문제도 따른다. 기존 현미경으로 작은 표적을 확대하기 위해서는 이 신기술은 물체의 존재를 확인하는 역할을 형광 대신 분자가 대신하고 있다. 초록색이나 빨간색 형광 대신에 GCAT로 구성된 염기서열이 대신한다. 빛을 쓰지 않기에, 빛을 통해 물질의 존재를 확인할 때 생기는 문제점이 발생하지 않는다. [그림 1] DNA Microscopy 3D 영상과 기본 검사 원리 모식도 [그림 1]에서 나온 것이 이 논문의 표지 사진이자 얻을 수 있는 영상 결과물이다. 보는 것과 같이 형광 현미경에서 볼 수 있는 선명한 영상은 기대하기는 어렵다. 그러나 위에 기술한 장점만으로도 향후 이 기술의 발전을 기대해 볼만한 충분한 가치는 있다고 생각한다. 이 기술의 요점은 다음과 같다. 첫째, 고정시킨 세포를 In-situ Amplification과 Molecular Identifier를 이용해 RNA 정보를 세포 형태를 유지시킨 채 핵산을 증폭시킨다. 증폭된 핵산 분자가 단순 확산(Simple Diffusion) 과정을 통해 주변으로 퍼져 나가고, 두 개의 분자가 서로 만나면 Overlapping Oligo라는 인공적 서열로 인해 하나의 서열로 합쳐 지게 된다. 둘째, 증폭된 서열을 NGS로 읽어서 서열의 수와 합쳐진 염기 서열이 포함된 비율을 이용해 서열 간의 3차원적 거리를 추론한다. 셋째, 거리 정보들을 기반으로 3차원 영상으로 추정하여 구현한다. [그림 2] DNA Microscopy의 작동 방식 여기서 Molecular Identifier는 Cell Free DNA 검사 등 NGS 검사 영역에서는 변이 검출 오류를 줄이는 목적으로 사용되는 것으로 최근에 많은 연구에서 사용되고 있는 Unique Molecular Identifier(UMI)와 사실상 동일하다. 이 기술을 이용하면 핵산 분자 하나하나를 표지 할 수 있다. 쉽게 말하면 DNA나 RNA마다 주민등록증을 발급하는 것과 같다. UMI가 동일한 서열은 동일한 핵산에서 기원된 것이라고 볼 수 있다. 그리고 Overlapping Oligo는 OE-PCR이라는 기술에서 사용되는 두 개의 염기 서열을 붙이기 위해 사용되는 Oligo이며, 말단부끼리 결합할 수 있는 상보성을 띄는 염기 서열을 가진다. Overlapping Oligo는 Unique Event Identifier(UEI)라고 명명된 또 다른 표지자를 가지고 있다. 만약 UEI를 가진 염기 서열 정보의 양 말단이 서로 다른 UMI를 가지고 있다면, 이들은 서로 다른 핵산 분자가 붙어서 만들어 진 것이다. [그림 2] 고정된 세포의 3차원 구조 상에 존재하는 분자 간 거리가 가까워야 서로 만나서 연결될 가능성이 많아질 것이고, NGS에서도 더 많은 Read를 생산하게 된다. [그림 2], [그림 3] 반대로 한 Read 내에 두 개의 UMI를 가진 것들 것 적게 생산되었다면, 이에 UMI에 태깅된 서열은 물리적 거리가 서로 먼 것으로 추정할 수 있다. [그림 3] 확산에 따른 UEI 수와 핵산 분자 수 간의 관계 거리 계산은 영상 정보는 전혀 없는 상태에서 진행된다. NGS 데이터를 얻기 위해서는 In-situ Amplification을 썼다 하더라도 결국에는 무언가를 갈고 부셔서 튜브에 넣고 각종 시약을 섞은 후 기계에 넣어야 한다. 즉, 원래 세포가 가지고 있던 3차원적 구조는 사라진 상태로 NGS 장비에서 디지털 신호로 변경되게 되는데 이를 가지고 다시 3차원 형태로 재현하는 것은 컴퓨터와 복잡한 수리 통계가 담당한다. UMI와 UEI의 서열과 그 수를 확률론적으로, 가능한 경우의 수를 계산하여 사라진 3차원 정보를 가상의 이미지로 재현해 내고 개별 분자 간의 추정된 거리 정보만을 이용해 3차원 형태로 구현하는 것이다. 이 과정을 비유하자면 사과를 믹서기에 갈아서 마신 후 그 맛을 기반으로 사과의 형태를 예측해 내는 것과 같다. 이 마술 같은 과정에 대해 자세히 알고 싶거나 혹은 단순히 두통을 느껴 보고 싶은 독자가 있으시다면 이 논문^[1]의 Method 부분 20~24페이지를 읽어 보시기 바란다. 결론을 내리면, DNA Microscopy라는 기술을 통해 기존의 광학 한계를 뛰어넘는 분자 현미경을 저자들은 구현할 수 있었고 세포 단위 유전자 발현을 확인할 수 있는 수단을 만들어 냈다. 사용한 장비도 임상에서 도입해 볼 만한 수준의 장비(NextSeq 550)를 사용한 결과이기에 더욱 의미가 있을 것 같다. 앞으로는 암을 진단하기 위해 암세포를 현미경으로 관찰하는 것이 아니라 NGS로 만들어 낸 영상을 모니터로 관찰해서 진단하는 세상이 올지도 모르겠다. [참고문헌] [1] Weinstein JA, Regev A, Zhang F. DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction. Cell. 2019;178(1):229–241.e16. [2] Gall JG, Pardue ML. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969;63(2):378–383. [3] Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, 141–145 (1981). [4] Tokunaga M, Imamoto N, Sakata-Sogawa K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells [published correction appears in Nat Methods. 2008 May;5(5):455]. Nat Methods. 2008;5(2):159–161. [5] Schueder F, Lara-Gutiérrez J, Beliveau BJ, et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun. 2017;8(1):2090. Published 2017 Dec 12. doi:10.1038/s41467-017-02028-8
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